Enfeksiyon haftalıklarının teşhisinde kan, üç ayrı mikrobiyolojik yöntemle incelemeye tabi tutulur.
8 KLİNİKLE İLİŞKİLİ MİKROBİYOLOJİK İŞLEMLER
a)Mikroskopik incelemeler
b)Kültürler
c)Serolojlk incelemeler
a)Mikroskopik incelemeler:
1)Antikoagülanlı kandan; bir damla kan, lam lamel arasına konularak ışık mikroskobunda incelendiği zaman, eritrositler arasında ve eritrositleri sağa sola iterek hareket eden mikrofilar-yalar tespit edilebilir.
2)Antikoagülanlı kanda veya santrifüj edilerek eritrositleri ayrılan kan serumunda; karanlık saha mikroskobunda, borrelia ve leptospira aranabilir.
3)Boyalı preparatlardan; kalın damla ve yayma preparatlar giemsa ve wright boyaları ile boyanarak, plazmodi, tripanazom, leşmania ve filarya yönünden incelenirler.
b)Kültürler:
Kan, klinik mikrobiyoloji laboratuarları için çok önem taşıyan bir kültür materyelidir. Zira, bu materyele ait kültür teknikleri tam olarak yerine getirildiği zaman elde edilen sonuçlar ister pozitif ve isterse negatif olsun daima bir anlam taşır. Kültürden elde edilen pozitif bir sonuç infeksiyonu teşhis ettirdiği veya şüphemizi teyid ettiği için değerli olduğu gibi, müteaddit kültürlerden alınan negatif bir sonuç da, en azından, hastadaki belirtilerin bakteriyel bir infeksiyonla ilişkili olmadığını bildirmesi bakımından önemlidir. Ancak, kan kültürlerinden beklenen bu sonuçların mümkün olduğu kadar süratli ve güvenilir olması gereklidir.
Normalde steril bir ortam olan kan aşağıda belirleyebileceğimiz durumlarda bakteri ihtiva eder. Kanda bakteri (bakteriemi) üç şekilde bulunur.
b)İntermitten olarak; genellikle doku ve organlardaki kapalı lezyonlardan (apse, empiyem vs.) bakteriler evvela lenf yollarına, oradan da ara sıra olmak üzere kana karışırlar. Bakteri miktarı fazla olabilir. Eğer lezyon klinik olarak lokalize edilememişse, bakteri izole edilinceye kadar “nedeni belli olmayan ateşler” arasında sayılırlar.
KLİNİKLE İLİŞKİLİ MİKROBİYOLOJİK İŞLEMLER
c) Devamlı olarak; endokarditlerde, intravasküler infeksiyon odaklarının olduğu, enfekte kateterlerin bulunduğu hallerde ve bunlardan ayn olarak tifo ve brusella gibi sistemik infeksiyon-ların, bakterieml devrelerinde görülür. Bakteriel endokarditlerde, kandaki bakteri sayısı az olmasına rağmen, devamlı bakteriemi olduğu için, alınan ilk iki şişede dahi bakteriyi tespit etme şansı çok yüksek olmaktadır. Ancak tedaviye başlanmışsa bu şans süratle azalmaktadır.
Kan kültürü yapılırken uyulması gereken teknik ve özellikleri iki gurupta toplayabiliriz.
A. Klinisyenin uyması gerekenler
B.Laboratuarcının uyması gerekenler.
A.Klinisyen için uyulması gerekenler :
1. Kan kültürleri hastalardan daima antibiyotik verilmeden evvel alınmalıdır. Eğer hasta antibiyotik alıyorsa, kan kültürü, müteakip antibiyotik dozunun verilmesinden hemen evvel (serum taban seviyesi) alınmalıdır.
2. Kan alınmasında zamanlama çok önemlidir. Ateşin yükseldiği esnada alınan kan kültüründen olumlu sonuç çıkmayabilir. Zira ateşin yükselmesi, bol miktarda bakterinin kanda bulunmasından bir saat sonra olur. Yani ateş yükseldiği anda bakteriler kandan kaybolmuşlardır. Bu tür intermittan bakteriemi gösteren durumlarda, en ideal kan alma zamanı, ateşin yükselmesinden bir saat evvelki zamandır. Ancak bu süre her zaman ayarlanamaz. Bunun için bu tür hastalarda sık sık ve rast-gele kan almak zorunluğu vardır. Akut infeksiyonlarda, infeksiyonların alevlenmeleri esnasında ve intravasküler patolojilerde her zaman kan alınabilir. Kronik vakalarda, kan kültürleri ile birlikte kemik iliği aspirasyonlan çok değerlidir.
3. Kan alınacak bölgedeki cilt temizliği çok önemlidir. Bunun için bölge evvela %70’lik alkolle merkezden çevreye doğru olmak üzere iyice temizlenir ve arkasından aynı bölgeye iod tentürü uygulanır ve kısa bir süre beklendikten sonra kan alınır. Kan alma işi bittikten sonra aynı bölgedeki iod, tekrar %70 lik alkolle temizlenir. Aynı işlem kan alacak şahsın parmaklarına da uygulanır.
4. Kan alınırken damar bulmakta güçlük çekiliyorsa, kontaminasyonu önlemek için daima iğne değiştirilmelidir. Kan kültürlerinde kontaminasyonu arttıran nedenlerden biri de, çok gayeli kan almaktadır. Araya başka test ve istekler karıştırılmamalı ve kan kültürü için intravenöz set ve kateterler-den kan almamalıdır. Kan alma işi ya bu iş için hazırlanmış bir ekip tarafından yapılmalı veya kan kültürünün Önemini bilen kişiler tarafından alınmalıdır.
5. Enjektörle kan alınıyor ve kapaklı kültür şişeleri ile çalışılıyorsa, iğnenin ucu ve şişe ağızları, kan koyarken alevden geçirilmelidir. Kapalı sistemlerle çalışırken böyle bir davranışa gerek yoktur.
6. Alınacak kan hacmi, az sayıda mikroorganizma bulunabüe-
10 KLİNİKLE İLİŞKİLİ MİKROBİYOLOJİK İŞLEMLER
cek infeksiyonlarda önem taşır. İdeal olan, erişkinler ı- 20 mi, kan alıp iki şişeye bölmektir. Çocuklarda kan hacmi az olduğu için, normal olarak kanın nü.sindeki bakteri sayısı daha fazladır. Bundan dolayı bebek ve küçük çocuklarda kan kültürü için 1-5 mi. kan yeterlidir. Aynı anda doldurulacak şişelerin hepsi tek kültür sayılacağı için iki şişeden fazla kan alınmamalıdır.
7. Kültür sayısı ne kadsr fazla olursa olsun, izolasyon şansı da o kadit artacaktır. Bir kültürle pozitiflik sayısı %80, 24 saat sonra alınacak ikinci kültürle bu oran %90 ve üçüncü bir kültürle bu oranın %99’a yükseleceğini unutmamalıyız. Acil vakalarda kültürlerin arası 3, 2 ve hatta yanın saate kadar indirilebilir.
Böylece gereken tedaviye de hemen başlanabilir.
8. Kan kültürlerine ait istek belgelerine, hastayla ilişkili ve laboratuarı yönlendirebilecek tüm bilgilerin kaydedilmesi ve hastada ne gibi bir infeksiyondan şüphe edildiği bildirilmelidir. Örneğin; brusella şüphesinde, normal süreden daha fazla takip, gereken bakteriler için CO2 li ortam, pnömokök ve patojen neisserialar için 6-12 saat içindeki kör pasajlar vs.
B. Laboratuara için uyulması gerekenler :
1. Firmaların hazırladığı besiyerleri haricinde, kan kültürleri için zenginleştirilmiş ve çok yönlü besiyerleri kullanılmalıdır. Örneğin; trypticase broth, brain heart infusion, Columbia, brusella, tryptose gibi besiyerleri bu gaye için kullanılabilirler.
2. Monofazik besiyerleri kolay hazırlanır fakat pasajlar esnasında kontaminasyon Jh^imaîi artar. Difazik besiyerleri zor hazırlanır fakat pasaj yajSnten kontaminasyon ihtimali yoktur.
3. Besiyerlerine hiçbir antikoagülan ilave edilmemelidir. Anti-koagülan etkisi, antifagositer, antikomplemanter etkileri olan ami-noglikosid antibiotikler üzerine inhibitör etkileri bulunduğu bildirilen SPS (sodium polyanethol Sulfonat) bugün bütün ticari besiyerlerinde bir katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Araştırıcılara göre, gram negatif çomaklara etkili olmadığı, bazı gram müspet kokların üremesini arttırdığı fakat bazı bakterilerin üremesini de inhibe ettiği bildirilmiştir. Bu gün için kan kültürlerinde %0.025 yoğunluktan fazla kullanılmaması tavsiye edilmektedir.
4. Duvar defektli bakteriler için besiyerlerine %10-20 sakkaroz ilave edilmesi tavsiye edilmektedir. Ancak etkinliği tartışılabilir,
5. Antibiyotik ihtiva eden kanlar içine penicillinase benzeri maddelerin ilavesi pratik olmayıp kontaminasyon ihtimalini arttırır. Bu gibi hallerde, dilüsyonu arttıracak daha büyük kaplardaki besiyerleri kullanılır veya antibiyotiğin en düşük olduğu devrede kan alınır.
6. Kültürler 35-37ûC da inkübe edilirler. İstenildiği takdirde şişe kapaklan hafifçe gevşetilerek anaercb veya CO2 li ortama koyulabilirler. Kültürler normal olarak bir hafta takip edilirler. Özel durumlarda bu süre uzatılabilir.
KLİNİKLE İLİŞKİLİ MİKROBİYOLOJİK İŞLEMLER 11
7. Kültür şişelerinde bulanıklık, gaz kabarcıkları, hemoliz, şişenin dibine çöken kan tabakası üzerinde kolonilerin veya besiyerinin yüzeyinde zar oluşumu gibi görüntüler, üreme olduğunu gösterirler. Ancak sakkaroz ilave edilen şişelerde hemoliz ve SPS bulunan şişelerde bulanıklık olabileceği bazı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir. Üremelerden hemen değişik besiyerlerine pasaj ve gram boyalamaları yapılmalıdır. Üreme olduğu zaman, bilhassa kritik vakalarda klinisyene haber vermek yerinde bir davranış olur. Aynı anda idantifıkasyon ve antibiyotik duyarlılık testi(ADT) işlemlerine de devam edilir. Saf oldukları kabul edilen kültürlerden hem idantifikasyon ve hem de ADT yapılır. Eğer bundan emin değilsek pasajların sonucunu beklememiz gerekir.
8. Antibiyotiklerle karşılaştırma yönünden, bilhassa endokar-ditlerde, tüp dilüsyon testi uygulanarak MİC veMBC çalışılır.
9. Laboratuara gelen kan kültürleri içinde patojen neisserialar ve pnömokok gibi bakterilerden şüphe ediliyorsa, 6-12 saat içinde gereken besiyerlerine kör pasajlar yapmak gerekir. Zira bu bakteriler, besiyerinde bulanıklık oluşturamadan, en yüksek popülasyon düzeyine erişemeden otolize olmaya başlarlar.
10. Tek bir şişede üreyen salmonella için karar vermek kolaydır. Fakat cilt florasında bulunabilen bir bakteri için aynı karar verilemez. S.epidermidis, mikrokoklar, corinebakteriler ve basillus gibi mikroorganizmalar ürediğinde, eğer bu bakteriler hastaya ait şişelerden sadece birinde ürerse, genellikle kontaminasyon olarak kabul edilirler. Ancak aynı anda alınan diğer şişede veya değişik zamanlarda alınan şişelerde ürerlerse, dikkate alınır ve biyoşimik idantifikasyonlan yanında, ADT paternleri çıkarılarak aynı bakteri olup olmadıkları araştırılır. Kan kültürlerinden izole edilen difte-roidler hakkında tam karar vermeden evvel, benzerliklerinden dolayı listeria ve corinebakteri JK yönünden araştırılmalıdırlar.
11. Bakteriemüerin çoğu tek mikroorganizma ile oluşur. Ancak %5-6 oranında birden fazla bakteriye rastlanabileceğini unutmamak gerekir.
Bugün, kan kültürleri üzerinde yapılan araştırma ve çalışmaların büyük bir çoğunluğu, kültür süresinin kısaltılması yönünde olmaktadır. Bu gaye için değişik yöntemler uygulanmaktadır. Membran filtre kültürleri, radioizotop çalışmaları, gaz kro-matografi tekniklerinin uygulanması gibi.
Serolojik incelemeler.
Bakteriel enfeksiyonların teşhisinde, seroîojik testler büyük bir yer tutar.
Basit olarak, serolojik testlerin esasını teşkil eden antijen-antikor reaksiyonları, bilinen bir antijen karşısında bilinmeyen antikoru veya bilinen bir antikor yardımı ile bilinmeyen bir antijeni meydana çıkarmaya yarar.
Serolojik testlerin büyük bir çoğunluğu, teşhise yardımcı olduğu gibi hastalıkların prognozu hakkında ve yapılan tedavilerin olumlu olup olmadığı hakkında da bilgi verirler.
12 KLİNİKLE İLİŞKİLİ MİKROBİYOLOJİK İŞLEMLER
Serolojik testler hem kalitatif ve hem de dilüsyon yapılarak, kantitatif olarak da çalışılırlar.
Serolojik testlerde kullanılan antijen ve antikorlar ne kadar spesifikse, testlerden elde edilen sonuçlar da o kadar spesifiktir. Saf olmayan antijen ve antikorlarla çalışırken daima çapraz reaksiyonlarla karşılaşılır.
Bir çok serolojik testte, teşhise varabilmek için, çift serumla çalışmak (akut ve nekahat safhalarına ait kan) ve iki serum arasında titre farkının yükseldiğini görmek gerekir. Yapılan tek bir testle bu dilüsyon farkını incelemek mümkün değildir.
Klinik mikrobiyoloji laboratuarında kullanılan testlerle ya elde mevcut antijenlerle, hasta serumlanndaki spesifik antikorlar araştırılır veya hastadan izole edilen bir bakterinin, elde mevcut antiserumlarla idantifikasyonlan yapılarak enfeksiyonların teşhisine gidilir.
Serolojide kullanılan testler, değişik antijenantikor reaksiyonlarına dayanırlar; aglütinasyon, presipitasyon, flokülasyon, lizis, nötralizasyon, kompleman fiksasyon, opsonizasyon, pasif aglütinasyon (lateks, coag.), inhibisyon testleri,immünodifüzyon, immünoelektroforez, FAT, RAİ, ve ELISAgibi.